染色体外环状 DNA(Extrachromosomal DNA,简称 eccDNA) 已在许多物种当中发现,但此前在家蚕(Bombyx mori)等昆虫当中缺乏报道。家蚕丝腺细胞在幼虫发育阶段,虽然存在 DNA 复制,但却缺乏细胞分裂,形成遗传学上非常经典的多线染色体(Polytene chromosome)结构。那么,在家蚕幼虫丝腺特殊的发育阶段当中,eccDNA 是否在其中扮演一定的角色呢?云序客户苏州大学胡小龙、贡成良教授团队在昆虫学专业期刊 Insect Science 上发表论文,揭晓了这一答案。作者与云序生物合作,对家蚕的丝腺组织来源的 eccDNA进行了测序研究。在此基础上,该研究还**进行了单种 eccDNA 的体外合成以及体内转染,并证明了eccDNAfib-L 的浓度与 fib-L 的 RNA 水平乃至于蛋白质表达水平之间的正相关关系,为 eccDNA 的功能研究提供了一种全新的方法思路。

论文标题:Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in the silk gland of Bombyx mori
发表日期:2023年2月24日
发表期刊:Inesct Science
研究方法:eccDNAcircle-seq、eccDNA  Sanger 测序 等

1、家蚕丝腺 eccDNA 的特征
作者进行了家蚕丝腺组织来源 eccDNA 的测序(circle-seq),共计检测到了 35346 种 eccDNA。它们的大小从 30 bp 到 13569549 bp 不等,但绝大多数 eccDNA (占比 94.25%)都集中分布在 50 bp 到 1000 bp 的范围之内。eccDNA **来源于每一条染色体,惟第 11 号染色体的 eccDNA 数目*多,而第 2 号染色体产生的 eccDNA 数目*少。若考量 eccDNA 的来源密度,第 11 号染色体上的密度**,高达 88.9 eccDNA/Mb,而第 24 号染色体上的密度**,*为 63.9 eccDNA/Mb。在第 22 号染色体上发现了 3 处 eccDNA 来源热点区域(hot spots),而在第 3 号染色体上则未发现任何 eccDNA 来源热点区域。根据 eccDNA 的来源区域不同,它们被分为了基因间区(intergentic)、外显子(exonic)、内含子(intronic)、外显子加内含子(intron-exon)四大类别,其中基因间区来源的 eccDNA *多(占 58.6%),外显子来源 eccDNA 占比其次(38.2%),而内含子(2.9%)和外显子加内含子(0.3%)来源类型的 eccDNA 则较少。

2、eccDNA 成环位点周边序列具有保守性
作者通过测序数据分析了该项目中全体 eccDNA 成环位点的上下游 10 bp 序列的基序(motif)特征。eccDNA 起始位点上游 10 bp 的序列被定义为 Sequence I,eccDNA 起始位点下游 10 bp 的序列被定义为 Sequence II,eccDNA 终止位点上游 10 bp 的序列被定义为 Sequence III,eccDNA 终止位点下游 10 bp 的序列被定义为 Sequence IV。Motif 分析结果表明,各类基因区域来源类型的 eccDNA (包括基因间的、外显子的、内含子的和内含子加外显子来源的 eccDNA)当中,eccDNA 5′ 起始位点和3′ 终止位点两侧的序列具有相似的特征:Sequence I 和 III 之间存在重复特征(记为“direct repeat 1”),Sequence II 和 IV 之间也存在重复特征(记为“direct repeat 2”)

3、个别 eccDNA 的验证
作者从eccDNA测序结果当中随机选取4 个eccDNA候选物(BMSK_chr2:1844506−1844923,BMSK_chr26:266530−266944,BMSK_chr28:294996−295352,BMSK_chr14: 9692083−9692623)进行验证。针对理论成环位点的 Sanger 测序结果显示,这 4 个 eccDNA 候选物的实际成环序列与理论序列完全一致,验证了这些 eccDNA 的真实性。

4、eccDNA 上的携带基因
作者认为 eccDNA所携带的基因决定了它们的生物作用,因此使用GO 和 KEGG 对这些基因进行了通路和功能富集分析。*主要的的GO条目集中于对刺激的反应(response to stimulus)、细胞膜(membrane)和多种结合(binding)等类型,还有一些由eccDNAs携带的基因与多细胞有机体过程(multicellular organismal process)、内膜系统(endomembrane system)和有机环化合物结合(organic cyclic compound binding)有关。KEGG 分析结果则显示,eccDNA 来源基因富集于 cAMP 信号通路(cAMP signaling pathway)、爱帕琳肽信号通路(Apelin signaling pathway)、胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)、肾上腺素信号通路(Adrenergic signaling pathway)、胰***素信号通路(Glucagon signaling pathway)、*****释放**信号通路(Gonadotropin-releasing hormone signaling pathway)、醛固酮合成和分泌信号通路(Aldosterone synthesis and secretion signaling)、GABA 能突触信号通路((GABA)ergic synapse)以及过氧化物酶增殖体**受体信号通路(Peroxisome proliferator-activated receptor signaling pathway)。

 并且,eccDNA 上携带有蚕丝蛋白相关的基因。例如:来自BMSK_chr25: 560150−11093027 的 eccDNA 上携带了 fib-H 完整基因(BMSK_chr25: 10496502−10511948)。此外,还存在多达 20 个 eccDNA 携带了 fib-L 基因(BMSK_chr14: 9687749−9700916)的一部分,其大小分布在 92 bp 到 1101 bp 之间,但并无任何 eccDNA 含有 fib-L 完整基因。此外,还有大量其它 eccDNA 上含有一部分蚕丝蛋白相关的基因。
5、对eccDNAfib-L的功能评估
作者选取了来自 chr14 上 9692083 位到 9692623 位的 eccDNA(后续记为 eccDNAfib-L)进行后续的实验。该 eccDNA 上携带有一部分 fib-L 基因的序列。通过针对成环位点的引物设计,作者进行了 RCA 滚环扩增,验证了这个 eccDNAfib-L的真实存在——滚环扩增产物的大小片段与理论长度的倍数相符。作者还对 eccDNAfib-L 行了荧光原位杂交(FISH),在五龄幼虫的丝腺当中检测到了荧光信号。综上所述,蚕的丝腺细胞具有产生eccDNAfib-L的能力。

为了验证 eccDNAfib-L 的生物学功能,作者使用 5’ 磷酸化引物以及 T4 连接酶在体外合成了不同剂量的eccDNAfib-L,并将它们转染到家蚕培养细胞当中,通过 qPCR 检测 fib-L 的 mRNA 水平。结果显示,fib-L 的 mRNA 水平与 eccDNAfib-L 转染剂量之间存在正相关的关系。作者随后还进行了体内实验,将 2 μg 体外合成的 eccDNAfib-L 注射到五龄幼虫的体腔(body cavity)内,并与注射了 PBS 的对照组五龄幼虫进行比较。在 eccDNA 水平上,注射组的 eccDNAfib-L 水平要高于对照组;在 fib-L 的 mRNA 水平上,无论是注射后 24、48、72 小时,都是注射组高于对照组;在 Fil-L 蛋白水平上,Western blot 实验也显示,无论是注射后 24、48、72 小时,都是注射组高于对照组。综上所述,eccDNAfib-L可以促进 fib-L 在 RNA 水平和蛋白质水平的表达。

小  结 

本文介绍了家蚕丝腺细胞中染色体外环状 DNA(eccDNA)的研究。通过测序分析,发现eccDNA在家蚕丝腺中存在,而且**来源于每一条染色体。eccDNA上携带有多种基因,包括与蚕丝蛋白相关的基因。作者针对其中一个eccDNAfib-L进行了功能评估,通过体外合成和体内转染实验,证明eccDNAfib-L可以促进蚕丝蛋白基因fib-L在RNA和蛋白质水平的表达。这项研究为eccDNA的功能研究提供了一种全新的方法思路,也为理解家蚕丝腺细胞发育和基因调控提供了新的认识。

云序生物eccDNA测序 

云序生物是国内率先提供环状DNA测序服务的公司,早在2018年已启动了环状DNA测序技术的开发。2019年,云序发布了组织细胞环状 DNA 测序(circle-seq),并成为A&A Bio**代理(该品牌的环状 DNA 纯化柱被绝大部分环状DNA高分文章采用)。2020年,云序又相继发布了体液样品环状DNA测序及体液样品环状DNA甲基化测序服务,拥有丰富的环状DNA测序产品线。云序生物环状DNA测序采用双端测序,上机测序数据量24G。迄今为止,我们已经完成上千例样品的环状DNA测序,积累了丰富的项目经验,样品类型涵盖:组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等,物种涵盖:人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。2021年,云序生物的客户发表国内首批 eccDNA 研究论文,其中更有发表于发表于 Nature Communications 上的高分研究 。
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1.组织细胞环状DNA测序
云序生物基于circle-seq的方法,采用多种手段包括柱纯化去除基因组DNA、酶消化去除线性DNA和线粒体DNA、滚环扩增放大信号,高效地纯化和富集环状DNA,再利用NGS测序和生信分析识别环状DNA。结合优化的实验流程,本环状DNA测序服务具有检出率高﹑准确性好等优点。
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云序生物eccDNA测序实验示意图 

2.体液样品环状DNA测序
针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品,云序生物参考卢煜明教授团队开发的方法,酶切去除线性DNA后,利用Tn5转座酶,打开eccDNA环状结构并同时在DN**段两端加上接头,进行建库及测序。Tn5转座酶法效率高,损耗低,实现血液循环系统中微量的环状DNA的检测。并且本产品能保留环状DNA的原始表达量,使得不同环状DNA间的表达量的比较更为准确。
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保留原始表达量,不同环状DNA间表达量比较更准确
3.体液样品环状DNA甲基化测序
针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品,云序参考卢煜明教授团队 2021 年研发的方法,酶切去除线性DNA后,利用Tn5转座酶,打开环状DNA环状结构并同时在DN**段两端加上接头,并用酶转化法将未甲基化的C转化为U,进行建库及测序。一次建库测序中同时检测样品中环状DNA及其甲基化位点的信息。

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往期eccDNA主题回顾

体液样品当中的环状DNA 有什么用?云序助力揭示髓母细胞瘤脑脊液eccDNA 的分子标志物潜质 

1区 IF=8.5 云序Circle-seq携手浙江大学研究者探索卵巢*eccDNA研究 

又一篇!云序circle-seq助力环状DNA在食管鳞*当中的**研究 

国内首篇,15分!云序circle-seq助力国内首篇10分以上环状DNA研究 

哈佛+Nature | 半个世纪的等待:eccDNA 三大关键问题答案全揭晓!